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http://www.abbs.info e-mail:[email protected] ISSN
0582-9879
ACTA BIOCHIMICA et
BIOPHYSICA SINICA 2003, 35(8): 761–767
CN 31-1300/Q |
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Short Communication |
Expression and Characterization of Kringle 1－5 Domains of Human Plasminogen
ZHOU Qing-Wei, XIE Jing-Li1, XIN Li, YE Qin1, LI Zai-Ping, GAN Ren-Bao*
( Institute of Biochemistry and Cell
Biology, Shanghai Institutes for Biological Sciences, the Chinese Academy of
Sciences, Shanghai 200031, China; 1State Key Lab of Bioreactor of
East China University of Science and Technology, Shanghai 200237, China )
Abstract The cDNA encoding Kringle
1－5 domains of human plasminogen
(designated as K1－5), obtained from HepG2 by
RT-PCR, was cloned into expression vector pHIL-S1. The recombinant plasmid
pHIL-K1－5 was transformed into Pichia
pastoris GS115 and the recombinant yeast was induced by methanol to express the
recombinant protein. The expressed protein was purified by lysine affinity
chromatography. The recombinant K1－5
inhibited the growth of bovine aortic endothelial cells (BAEC) stimulated by
the basic fibroblast growth factor (bFGF), in a dosage-dependent manner, with a
half maximal concentration of 14 mg/L. And rhK1－5
inhibited 47% of the BAEC migration stimulated by bFGF at the concentration of
50 mg/L. rhK1－5 also affected the cell cycle
of BAEC and caused G0-G1 arrest at the concentration of 14 mg/L.
Key
words K1－5; Pichia pastoris; expression;
purification; bioactivity
_________________________________________
Received:
April 10, 2003 Accepted:
May 15, 2003
*Corresponding
author: Tel, 86-21-54921102; Fax, 86-21-54921011; e-mail, [email protected]
人纤溶酶原Kringle
1－5结构域的表达及活性鉴定
周庆玮 谢静莉1 辛利 叶勤1 李载平 甘人宝*
( 中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所, 上海 200031;1华东理工大学生物反应器国家重点实验室, 上海 200237 )
摘要 利用RT-PCR的方法从人肝癌细胞株HepG2细胞内获得了编码人纤溶酶原(hPlasminogen) 的Kringle
1到5 (简称K1－5)的cDNA, 将其克隆到表达载体pHIL-S1中。
将重组载体pHIL-K1－5转化毕赤酵母GS115,
得到的重组菌株用甲醇进行诱导表达, 并利用赖氨酸亲和柱纯化重组蛋白质。 重组蛋白质K1－5能特异性地按剂量依赖的方式抑制碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)刺激的牛主动脉内皮细胞(BAEC)的增殖, 浓度为14
mg/L时达到最大抑制效果的50％; K1－5能抑制bFGF引起的BAEC的迁移, 50 mg/L的K1－5对BAEC迁移的抑制率为47％;
K1－5还能影响BAEC细胞的周期,
14 mg/L的K1－5使细胞在G0～G1期积聚。
关键词 K1－5; 毕赤酵母; 表达;
纯化; 生物活性
20世纪70年代, 哈佛大学的Folkman教授提出： 肿瘤的生长与血管生成密切相关[1,2]。
他提出了一种新的治疗肿瘤的方法： 通过抑制血管生成抑制肿瘤生长。
这为治疗肿瘤提供了一种新的思路[3]。
许多实验证明了肿瘤的生长和迁移依赖于血管的形成[4～6]。 血管抑素(angiostatin)是O’Relly等[7]在1994年发现的第一个内源性的血管抑制因子, 它在体外能特异性地抑制血管内皮细胞的增殖和迁移, 并能抑制多种肿瘤的生长和转移[8]。 由于血管抑素(angiostatin)作用专一性强, 无毒性耐药性的产生,
因而一度成为肿瘤治疗药物的开发热点[9], 目前美国EntreMed公司研制的血管抑素(angiostatin)已经进入二期临床。
序列分析表明血管抑素(angiostatin)是纤溶酶原水解后的产物, 它包含人纤溶酶原(hPlasminogen)的前4个Kringle结构(图1)。
Kringle结构是由约80个氨基酸组成的内部含有3对二硫键的圆饼状结构域,
对赖氨酸有很高的亲和力, 存在于很多蛋白质中[10]。 研究发现[11,12]纤溶酶原的5个Kringle结构单独作用时,
抑制内皮细胞生长的活性各不相同, 它们的活性的高低依次为K5、
K1和K3, K2活性不高, 而K4基本没有活性; 另外,
Kringle 1－5各个组合后也具有不同的抑制内皮细胞生长的活性： K2－3 抑制活性和K2相似, K1－3活性大于K1－4。
重组K4－5也能显著抑制BCE细胞增殖与鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)新生血管的生成[13]。
表1比较了一系列Kringle结构域的生物活性,
以达到最大抑制效果50％时的作用浓度(ED50)表示。
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Fig.1 Schematic structure of
plasminogen |
Table 1 Bioactivity of
different Kringle domains of human plasminogen
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序列分析结果表明,
纤溶酶原中的第五个Kringle结构域(K5)和其他4个Kringle结构(K1～K4)在一级结构的同源性分别为57.5％、 46.25％、
48.75％和52.％(图2)。
本实验室发现人肝细胞生长因子的第一个Kringle结构域(HGFK1)与纤溶酶原的Kringle结构域序列同源性较高, 将其克隆表达后发现它具有较强的抑制内皮细胞生长的能力[14]。 另外, 纤溶酶原经尿激酶激活后生成一个新的血管生成抑制剂, 它包括纤溶酶原的Kringle
1－4及部分Kringle 5结构(简称K1－4.5),
具有较高的生物活性, 是一个很有潜力的血管生成抑制剂[15]。 我们实验室克隆了K1－4.5的基因, 将其在毕赤酵母GS115中进行分泌表达, 发现K1－4.5活性与血管抑素接近[16]。
到目前为止, 对于完整的Kringle 1－5基因的克隆表达和生物活性未见报道。
Fig.2 Sequence alignment of the five plasminogen Kringle domains of human plasminogen
本文应用PCR方法扩增人纤溶酶原Kringle 1－5(简称K1－5)的cDNA, 克隆到毕赤酵母表达载体pHIL-S1中, 以分泌蛋白质的形式在毕赤酵母GS115中进行表达, 将表达上清液通过赖氨酸-Sepharose 4B层析柱纯化, 得到的重组蛋白质用牛主动脉内皮细胞(BAEC)测定其生物活性。 我们发现,
K1－5能按剂量依赖的方式抑制bFGF刺激的BAEC的增殖, 并能抑制BAEC的迁移和影响BAEC的细胞周期。
1 材料和方法(Materials
and Methods)
1.1 材料
1.1.1 细胞和菌株 大肠杆菌Top10F和毕赤酵母菌株GS115
(His4, Mut+) 购自Invitrogen 公司; 人肝癌细胞株HepG2为中科院生化细胞所保存; 牛主动脉内皮细胞(BAEC)为上海中医药大学惠赠。
1.1.2 毕赤酵母表达载 体表达载体pHIL-S1购自Invitrogen
公司。
1.1.3 试剂盒及主要试剂和材料 SuperScript
RNase H－反转录试剂盒购自TaKaRa公司; pfu Taq聚合酶购自生工公司;
DNA凝胶电泳回收试剂盒购自博彩公司; 消解酶(Zymolase)100T购自Invitrogen 公司;
MTT及限制性内切酶和连接酶均购自华美公司; 电转杯购自Bio-Rad公司;
细胞培养基购自Gibco BRL公司; 酵母抽提物、
Polypepton以及酵母氮碱均购自DIFCO公司; PI染料购自华舜生物工程有限公司, 其他试剂均为国产分析纯; X光片购自Kodak公司;
Transwell购自强生公司。
1.1.4 引物合成和DNA序列测定 DNA引物由塞百盛公司合成并经PAGE纯化,
DNA序列测定由联合基因公司完成。
1.2 方法
1.2.1 细胞总RNA的提取 采用Gibco BRL公司的Trizol试剂, 按说明书操作。
1.2.2 RT-PCR扩增 目标序列以总RNA为模板,
K1－5特异引物1和引物2进行RT-PCR。 45 ℃温育30 min, 进行逆转录, 条件如下：
94 ℃变性30 s, 50 ℃退火30 s, 70 ℃延伸90
s。 共进行35个循环。
引物1： 5'-TTATTTGAAAAGAAAGTGTATCTCT-C-3'
引物2： 5'-ATCAAATGAAGGGGCCGCACAC-3'
1.2.3 PCR扩增用于构建表达载体的DNA片段以RT-PCR产物为模板, 用引物3和引物4进行PCR反应扩增用于构建pHIL-S1表达载体的DNA片段。 反应条件为： 94 ℃变性30 s, 55 ℃退火30
s, 72 ℃延伸90 s。
共进行30个循环。
引物3：
5'-ATCGCTCGAGCGTTATTTGAAAAG-AAAGTGTATCTC-3' (斜体下划线部分为XhoI酶切位点)
引物4： 5'-ATCGAATTCTAATCAAATGAAGGG-GCCGC-3' (斜体下划线部分为EcoRI酶切位点)
1.2.4 PCR产物的克隆和鉴定 PCR扩增的DNA片段用1％琼脂糖凝胶电泳后回收, 分别用XhoI和 EcoRI酶切,
经回收后连接到经XhoI和 EcoRI酶切处理的载体pHIL-S1上。
将连接产物转化大肠杆菌Top10F后, 以XhoI和EcoRI双酶切鉴定。 将得到的阳性克隆pHIL-K1－5进行 DNA序列测定。
1.2.5 重组质粒电转化 毕赤酵母GS115将10
μg构建好的载体pHIL-K1－5用BglII酶切3～4 h, 酚-氯仿抽提, 乙醇沉淀后溶于10
μL无菌水中备用。 将GS115甘油菌划线于YPD平板,
30 ℃培养48 h后挑取单克隆到3 mL YPD液体培养基中,
30 ℃、 200 r/min培养过夜。 取10～50 μL过夜菌接入新鲜的50 mL YPD液体培养基中,
30 ℃、 200 r/min培养至A600介于1.3～1.5。 将菌液于1500 g、
4 ℃离心5 min, 倾去上清液。 菌体重悬于50 mL无菌水中, 于1500
g、 4 ℃离心5 min, 倾去上清液。 重复洗涤一次。 菌体重悬于2 mL冰冷的1 mol/L D-山梨醇中,
1500 g, 4 ℃离心5 min, 倾去上清液。 菌体重悬于0.1 mL冰冷的1 mol/L D-山梨醇中。 取5 μg处理好的质粒加入经上述处理的80 μL感受态细胞中, 冰浴5
min, 以25 μF/1500 V的条件电击,
加1 mL冰冷的1 mol/L D-山梨醇,
取适量涂于MD平板, 30 ℃培养至克隆长出。
1.2.6 阳性酵母转化子的鉴定 从转化平板上挑取单克隆, 转接在新鲜的MD平板上, 30 ℃培养48
h。 分别挑取单克隆浸入10
μL浓度为3 g/L的消解酶(Zymolase)中, 室温放置10
min后, 放入液氮中冻结。 室温下解冻后, 各取5 μL作为PCR反应的模板,
使用引物5和引物6 进行PCR鉴定。 反应条件为： 94 ℃变性30 s, 55 ℃退火30
s, 72 ℃延伸90 s。
共进行30个循环。
引物5： 5′-GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3′ (5′Aox1)
引物6： 5′-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3′ (3′Aox1)
1.2.7 重组子的发酵培养 将得到的重组酵母甘油菌0.7 mL接入25
mL 种子培养基(每升含13.4 g酵母氮碱、
10 mL甘油、 0.4 mg生物素、 100 mL 1 mol/L pH 6.0 磷酸缓冲液、 酵母抽提物 10 g、
多聚蛋白胨 20 g)中, 在250
mL摇瓶中30 ℃培养14 h, 此即为一级种子。 将一级种子分别接入3个50
mL 种子培养基中, 在500 mL摇瓶中培养7.5
h, 此即为二级种子。 将此二级种子接入2.5
L发酵培养基(每升中含18.2 g K2SO4、 7.45 g MgSO4、 0.93 g CaSO4、 26.7 mL 85% H3PO4、 4.13 g KOH、
40 g甘油、 4.35 mL PTM1溶液, 氨水调节pH至5.0), 其中每升PTM1中含65 g FeSO4·7H2O、 6 g CuSO4·5H2O、 20 g ZnSO4、
3 g MnSO4、 5 mL 浓硫酸、 0.02 g HBO3、 0.2 g NaMoO4、 0.08 g NaI、
0.2 g生物素。 批培养结束后,
流加甘油, A600达180时开始诱导培养,
用甲醇电极控制甲醇浓度为0.3%。
约150 h后停止培养。 发酵过程中温度控制在30 ℃, pH为5.0,
通气量在1～1.5 vvm。
1.2.8 发酵液的纯化 将发酵液离心, 4 ℃、
10 000 r/min、 15 min, 收集上清液, 加入1/4体积的5×PB溶液, 上样于赖氨酸-Sepharose
4B亲和柱, 控制流速1 mL/min。 用PB溶液洗至基线后,
再用PBS溶液洗去非特异结合的蛋白质, 然后用0.2
mol/L 6-氨基己酸(EACA)溶液洗脱目的蛋白质。 洗脱峰溶液对双蒸水4
℃透析过夜, 冻干后溶于适量无菌水中。 将目的蛋白质用BCA法定量, 取5
μg蛋白质进行12％SDS-PAGE电泳, 考马斯亮蓝染色。
1.2.9 重组蛋白质对BAEC增殖的抑制 3～5代培养的牛主动脉内皮细胞(BAEC)培养于DMEM＋10％FBS中。 接3000细胞/孔于96孔板中,
待2～3 h后细胞贴壁,
吸去培养基, 加入50 μL含2％FBS的DMEM, 分别加入不同浓度的样品。
37 ℃保温1 h, 补加含碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的DMEM+2％FBS 50 μL使bFGF终浓度为5
μg/L, 37 ℃培养48 h。 每孔加入10 μL
10 g/L的MTT(噻唑蓝), 37 ℃保温4
h。 吸去80
μL培养基, 加入100
μL二甲亚砜, 振荡溶解后测A570。
用Sigma Plot软件分析数据。
1.2.10 重组蛋白质对BAEC细胞迁移的抑制 BAEC细胞用DMEM＋10％FBS培养液传代培养,
以DMEM＋2％FBS培养液作实验用培养液, 临用时配成1×105/mL的细胞悬液。 在迁移板的上下槽加入实验用培养液, 置37 ℃和5％CO2培养箱中温育1
h以上使用。 取100
μL细胞悬液接种到24孔transwell的上槽中, 下槽中加入600
μL培养基。 待细胞贴壁后在上槽中加入K1－5蛋白使其终浓度为50
mg/L, 对照孔中加入培养基; 在下层培养基中加入bFGF使其终浓度为10
μg/L, 样品及对照各做2个孔。 12 h后将上槽取出, 吸出其中的培养液, 用棉签轻轻擦去迁移膜表面的细胞, 再用PBS溶液轻洗除去迁移膜表面的细胞碎片。 迁移膜经冰冷的甲醇固定后用Giemsa染液染色并在20×物镜下计数。 每个孔随机取6个视野计数后取平均值。
1.2.11 重组蛋白质对BAEC细胞周期的影响 在60 mm培养皿中接种2×105个牛主动脉细胞(BAEC),
DMEM+10％FBS培养基培养。 贴壁后吸取培养基, 加入14 mg/L 重组K1－5蛋白＋DMEM+10%FBS+10
μg/L bFGF, 对照组不含K1－5蛋白。 培养8 h后用胰酶消化细胞, 2000 r/min离心 5 min后取细胞在70％乙醇中固定1 h, 2000 r/min离心 5 min后收集细胞,
每管加200 μL 1 g/L的RNase
A在37 ℃处理30 min。
2000 r/min离心 5 min, 每管加入400 μL
浓度为100 mg/L PI染色液, 4 ℃避光放置30
min。 测定及数据处理由中科院生化细胞研究所流式细胞仪实验室完成。
2 结果(Results)
2.1 毕赤酵母表达质粒pHIL-K1－5的构建
抽提人肝癌细胞株HepG2总RNA。 以它为模板, 用引物1和引物2经RT-PCR扩增得到K1－5的cDNA片段[图3(A)]; 以RT-PCR产物为模板, 用引物3和引物4经PCR扩增得到首尾含酶切位点的K1－5基因片段, 约1.5
kb[图3(A)]; 将该片段连接到处理好的pHIL-S1载体上,
经XhoI、 EcoRI双酶切鉴定得到阳性质粒pHIL-K1－5[图3(B)]。
测序结果表明, K1－5基因与报道的序列一致,
接头处阅读框架准确无误(数据未显示)。
Fig.3 Electrophoresis of DNA
(A) Electrophoresis of the products of
PCR. 1, the product of RT-PCR; 2, DNA marker; 3, the product of the gene of K1－5
by PCR. (B) Detection of pHIL-K1－5.
1, digestion of pHIL-K1－5
by XhoI and EcoRI; 2, DNA marker.
2.2 pHIL-K1－5电转化GS115及阳性转化子的筛选
用BglII彻底酶切pHIL-S1和pHIL-K1－5, 电转化GS115,
涂MD板, 30 ℃培养。 挑取平板上长出的单克隆, 处理后用Aox1的5′及3′引物进行PCR反应以鉴定重组子。
图4显示了3种酵母转化子PCR鉴定得到的结果。 泳道1是转化pHIL-S1质粒的酵母转化子的结果,
扩增出长度约为260 bp的片段, 表明Aox1基因被载体上的片段重组替换; 泳道3是转化pHIL-K1-5质粒的酵母转化子的结果,
扩增出长度约为1.7 kb[K1－5基因(1422
bp)+pHIL-S1质粒片段(262 bp)], 表明Aox1基因被K1－5基因重组替换。 泳道4是GS115空菌的结果, 扩增出长度为2.2
kb的片段, 即Aox 1基因。
Fig.4 Detection of recombinant yeast DNA by PCR
1,
GS115 transformed by pHIL-S1; 2, DL2000 DNA molecule marker; 3, GS115
transformed by pHIL-K1－5;
4, GS115.
2.3 重组子的发酵培养和纯化
将保存的重组酵母甘油菌先接种到种子培养基, 培养后接种到发酵培养基中进行发酵培养。
将发酵上清液上样于赖氨酸亲和柱, 用EACA洗脱。 得到的洗脱峰透析后冻干, BCA法定量。 取5 μg
K1－5蛋白进行12％
SDS-PAGE电泳, 经考马斯亮蓝染色, 结果表明得到K1－5蛋白纯品(图5)。
Fig.5 SDS-PAGE of rhK1－5
1,
marker; 2, rhK1－5.
2.4 重组蛋白质抑制BAEC生长的活性测定
图6显示了一系列浓度的K1－5蛋白对BAEC生长的抑制作用,
重组蛋白质能特异性地按剂量依赖的方式抑制碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)刺激的牛主动脉内皮细胞(BAEC)的增殖,
达到最大抑制效果50％时的作用浓度为14 mg/L。
Fig.6 Inhibition of rhK1－5 on the endothelial cell proliferation stimulated by bFGF
2.5 重组蛋白质抑制BAEC迁移的活性测定
BAEC接种到转样孔(transwell)上层中贴壁后, 在上层培养基中加入浓度为50
mg/L的重组K1－5蛋白,
在下层培养基中加入bFGF(10 μg/L); 12 h后染色,
并在20×物镜下记数。 每个孔随机取6个视野计数后取平均值。 如图7所示, K1－5蛋白能抑制bFGF刺激的BAEC的迁移, 50 mg/L作用浓度时抑制率为47％。
Fig.7 Inhibition of rhK1－5 on the endothelial cell migration stimulated by bFGF
1,
control; 2, 50 mg/L rhK1－5.
2.6 重组蛋白质对BAEC周期影响的测定
BAEC接种到6
cm的培养皿中, 贴壁后加入浓度为14 mg/L 的重组K1－5蛋白＋DMEM+10%FBS+10
μg/L bFGF, 对照组不含K1－5蛋白。 培养8 h后用胰酶消化细胞, 经乙醇固定和PI染色后用FACS检测样品的细胞周期。
结果如图8, 对照组G0-G1期细胞为41.66%, S期细胞为49.7%;
加药组G0-G1期细胞为60.49%, S期细胞为26.79%。
可见, 重组K1－5蛋白可使BAEC大量积聚在G0-G1期, 处于S期的细胞相对百分比明显减少。
Fig.8 The effect of rhK1－5 on the endothelial cell cycle
(A)
Control. (B) 14 mg/L rhK1－5.
3 讨论
(Discussion)
酵母作为单细胞真核生物,
既具有原核生物生长快、 遗传操作简单的特点,
又有哺乳类细胞的翻译后加工和修饰的功能。 酿酒酵母(Saccharomyces
cerevisiae)是第一个用于表达外源基因的真核系统[17], 但这一系统在工业化生产中存在许多不足, 如菌株不稳定、 产量和分泌效率低、 分泌的多肽常过度糖基化等等[18]。 甲醇营养型酵母(简称甲醇酵母)是最近十年逐渐发展起来的一类可用于表达外源基因特别是真核生物基因的理想系统。 这类酵母分属假丝酵母(Candia)、
汉逊酵母(Hansenula)、
毕赤酵母(Pichia)和球拟酵母(Torulopsis)四个属[18], 并能在以甲醇为惟一碳源和能源的培养基上生长。
与酿酒酵母相比,
毕赤酵母作为新近发展起来的表达宿主, 具有发酵上清液中杂蛋白质少、 可以高菌密度发酵、
遗传学稳定等优点[19]。
目前这个表达系统得到了非常广泛的应用, 例如血管抑素(angiostatin)[20]以及人血管内皮生长因子(VEGF165)[21]等都在这个系统成功地进行了表达。 由于本实验目的蛋白质K1－5的分子量较大,
绝对分子量53 kD, 为了得到天然构象的蛋白质, 我们选用分泌蛋白质的形式表达。
此外, 毕赤酵母产生的重组蛋白质具有的糖基化形式, 较啤酒酵母更类似于人类蛋白质的糖基化形式[22], 因此表达出来的蛋白质相对啤酒酵母和大肠杆菌, 更类似于人体内天然形式的蛋白质。
作为甲醇营养型的毕赤酵母,
有两个醇氧化酶基因Aox1和Aox2, 其中Aox1基因表达受甲醇严格调节和诱导, 而Aox2基因利用甲醇的效率比Aox1低得多。 我们采用的分泌型表达载体具有Aox1基因的调控元件,
表达质粒转化GS115后K1－5基因取代GS115 的Aox1基因整合于染色体中, 表现为甲醇利用缓慢(Muts)。
人纤溶酶原的各Kringle区同源性很高, 空间结构相似,
能不同程度地抑制血管内皮细胞的增殖[11, 12]。
我们表达的是完整的Kringle 1到5结构。 实验结果表明, rhK1－5的生物活性略低于血管抑素以及K1－4.5[16],
在血管抑素的C端加上一个完整的Kringle尾巴后,
整个分子抑制内皮细胞增殖和迁移的能力有所降低。 Ji等[23]研究人纤溶酶原中的第五个Kringle结构域(K5)发现,
K5的折叠结构可能遮挡了其内部的活性部位, 从而阻碍了其与内皮细胞的有效结合, 产生“盾牌效应”; 而如果将Kringle
5内部的二硫键还原和烷基化后则可能减轻这种效应。 目前,
Kringle 1－3球形的晶体的结构已经获得, Kringle 1－3形成的碗状结构产生了一个具有单一结构域的蛋白质, 显示了各个Kringle结构域的作用具有协同性[24]。
我们推测, 在Kringle 1－5分子的折叠结构中, 各个Kringle结构域的空间结构可能相互遮挡了各自的活性部位, 从而部分阻碍了K1－5分子与内皮细胞的有效结合, 从而使K1－5分子抑制内皮细胞增殖和迁移的活性有所降低。
如果分析K1－5可能的空间结构,
并有针对性地构建一些K1－5的突变体以减轻各个Kringle
结构域在空间结构上的相互遮挡, 会不会增强其活性呢？这有待我们进一步的实验证实。
在已知的内源性的血管生长抑制剂中, 约有50％是蛋白质降解片段, 如angiostatin、 endostatin、
serpin antithrombin、 tumstatin、 canstatin、
vasostatin、 prolactin、 restin和arresten[25－33], 它们的前体蛋白质不抑制血管形成。
目前, 对于肿瘤细胞中为何产生血管抑制剂, 以及机体如何调节它们与前体蛋白质间的平衡还没有令人满意的答案。 最近有报道发现,
K1－4.5在体内天然存在[34], 说明其有可能与体内调节血管生成的过程有关。
那么, K1－5也在体内天然存在吗？它们有可能是人纤溶酶原转化为血管抑素的中间产物吗？当然, 这些假设还有待证实, 通过研究K1－4.5和K1－5这两个分子在体内的功能将有助于探明生物体内调节血管生长的分子机制。
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